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小鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
更新更新時間：2019-06-05 瀏覽次數(shù)：3372
海馬體主要負(fù)責(zé)記憶和學(xué)習(xí)，日常生活中的短期記憶都儲存在海馬體中。神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)元具有長突起，由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成。
小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的組織來源于實驗小鼠的正常腦組織，因為海馬神經(jīng)元細(xì)胞類似于干細(xì)胞屬于高分度分化的細(xì)胞特性，具有不能傳代，不能增殖等特點，所有收到細(xì)胞后盡快使用。
1.試驗所需儀器設(shè)備及試劑
（1）儀器
生物安全柜
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱
熒光倒置顯微鏡
高速冷凍離心機
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱
（2）試劑耗材
T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
血球計數(shù)板
細(xì)胞培養(yǎng)孔板
紅細(xì)胞裂解液
神經(jīng)元*培養(yǎng)基
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）
多聚甲醛（PFA）
DAPI
Triton X-100
山羊血清
NSE
Goat anti-Rabbit lgG（H+L）
Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594
Fluoromount-G熒光封片劑
2.分離培養(yǎng)方法
1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，
2) 在冰浴的PBS中分離海馬，PBS洗滌3次，剪碎，
3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型膠原酶37℃水浴振蕩消化30min，
4) 用FBS終止消化，輕輕吹打，
5) 過100 μm 濾網(wǎng)，
6) 收集濾液，300 g離心5 min，
7) 用*培養(yǎng)基重懸沉淀，鋪瓶。
3.免疫熒光
3.1.實驗步驟
（1）細(xì)胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1mL，加入細(xì)胞0.02million個/孔。置培養(yǎng)箱2h或過夜。
（2）固定
細(xì)胞爬片后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可后一次不吸出PBS，放4℃過夜。
（3）破膜封閉
將玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上，
玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封閉液滴于防水膜上，將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋
破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中），將玻片（有細(xì)胞的一面）蓋上置于4℃（多可放置一周）
（5）二抗孵育
室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細(xì)胞的一面蓋上。
鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞
3.2.檢測結(jié)果
（1）細(xì)胞免疫熒光鑒定照片
陰性
100X-DAPI 100X-Fluorescence
NSE
100X-DAPI 100X-Fluorescence
（2）檢驗基本情況：
經(jīng)免疫熒光鑒定，該細(xì)胞純度達到90%以上。
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